217 กรณีศึกษาที่ 3: งาช้าง การจำแนกชนิดพันธุ์สายพันธุ์ของผลิตภัณฑ์งาช้างของกลางโดยการถอดรหัส พันธุกรรม คำนำ ตามที่ ได้รับตัวอย่างผลิตภัณฑ์งาช้างของกลาง คือ ผลิตภัณฑ์งาช้างแกะสลัก 7 ตัวอย่างและรกช้าง รายละเอียดแสดงดังตารางที่ 25.4 มาให้สำนักวิจัยการอนุรักษ์ป่าไม้และพันธุ์พืช เพื่อตรวจหารหัสพันธุกรรม นั้นในการนี้สำนักวิจัยการอนุรักษ์ป่าไม้และพันธุ์พืชได้มอบหมายให้ ข้าพเจ้าทำหน้าที่หัวหน้ากลุ่มงาน พันธุกรรมไม้ป่าและเทคโนโลยีชีวภาพในขณะนั้นทำการศึกษาวิจัยพันธุกรรมของตัวอย่างดังกล่าว ซึ่ง Changtragoon and Singthong (2010b) ได้ทำการวิเคราะห์โดยถอดรหัสพันธุกรรมจากยีนใน ไมโทคอนเดรีย 4 ชิ้นส่วนของยีนเพื่อจำแนกชนิดพันธุ์และกลุ่มของงาช้าง (subspecies) วิธีการวินิจฉัยพันธุกรรม การถอดรหัสพันธุกรรมมีวิธีการดังนี้ ได้นำตัวอย่างผลิตภัณฑ์งาช้างมาทำการกำจัดแคลเซียม (decalcification) โดยเริ่มจากการบด ตัวอย่างผลิตภัณฑ์งาช้างให้ละเอียด นำตัวอย่างผลิตภัณฑ์งาช้างที่บดละเอียด 200 mg+EDTA 1ml vortex จนละลาย (ประมาณ 2 นาที) เขย่าที่ 4 องศาเซลเซียส 24 ชั่วโมง หลังจากนั้น centrifuge 9000 g 10 นาที 21 องศาเซลเซียสแล้วทิ้งส่วนใส ทำซ้ำอีก 2 รอบ จากนั้นเติม dH2O 1ml vortex centrifuge 9000 g 10 นาที แล้วทิ้งส่วนใส ทำซ้ำ 2 ครั้ง จากนั้นนำตัวอย่างผลิตภัณฑ์งาช้างที่ผ่านการกำจัดแคลเซียมแล้วมาสกัด ดีเอ็นเอด้วยชุดสกัด DNeasy Tissue Kit (QIAGEN) แล้วนำดีเอ็นเอที่สกัดได้มาเพิ่มปริมาณยีน (PCR, polymerase chain reaction) ด้วยไพรเมอร์ ซึ่งเป็นยีนในไมโทคอนเดรียจาก การศึกษาของ Lei et al., 2008 ดังแสดงในภาพที่ 25.5 และเชื่อมต่อชิ้นดีเอ็นเอหรือยีนเข้ากับ พลาสมิดใช้ชุด pGEM-T Easy Vector System I kit (Promega, USA) ซึ่งมาพร้อมกับพลาสมิด pGEM-Teasy vector และถ่ายยีนเข้าสู่แบคทีเรีย เจ้าบ้าน (host) เพื่อเพิ่มปริมาณพลาสมิดสายผสม โดยวิธี CaCl2 heat shock transformation (Sambrook et al., 1989) หลังจากนั้นตรวจยืนยันชิ้นดีเอ็นเอหรือยีนที่อยู่ในพลาสมิดสายผสม หลังจาก เพิ่มปริมาณในเซลล์เจ้าบ้านโดยใช้วิธีโคโลนีพีซีอาร์ และสกัดแยกพลาสมิดให้บริสุทธิ์โดยใช้ชุดสกัด High Pure Plasmid Isolation Kit จาก Roche ในการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนที่ศึกษา จากหลักการ ของวิธี Chain termination method ใช้ชุด Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) โดยทำพีซีอาร์ซึ่งจะติดฉลากด้วยฟลูออเรสเซนต์จากนั้นนำ PCR product ที่ได้ไปทำให้ บริสุทธิ์ และนำสารละลายที่ได้มาวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ โดยใช้เครื่องวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA) ภาพที่ 25.6 แล้วจึงวิเคราะห์ผลลำดับ นิวคลีโอไทด์โดยการเปรียบเทียบความแตกต่างของลำดับนิวคลีโอไทด์ กับฐานข้อมูล gene bank ของโลกที่มีอยู่ ในเว็บไซด์ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (Changtragoon and Singthong, 2010b; Changtragoon, 2012)
การศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมโดยใช้เครื่องหมายดีเอ็นเอและไอโซเอนไซม์ยีน
To see the actual publication please follow the link above