36 ด้วยการทำพีซีอาร์แล้วนำดีเอ็นเอมาจับกับโอลิโกนิวคลีโอไทด์ซึ่งสังเคราะห์ขึ้นมาเป็นชุดซ้ำแบบ ไดนิวคลีโอไทด์ชนิด (CT)10 เพื่อให้จับกับส่วนที่เป็นไมโครแซทเทลไลท์ที่เป็น GA โดยใช้ MagneSphere® Magnetic Separation (Promega) จากนั้นนำดีเอ็นเอที่ได้จากการทำ hybridization มาตรวจสอบด้วยการทำ PCR อีกครั้งหนึ่งจากนั้นดีเอ็นเอที่ได้จากการทำไฮบริไดเซชั่นนำมาเชื่อมต่อกับดีเอ็นเอพาหะ pGEM-T easy vector system (Promega) แล้ว transformation เข้าสู่ แบคทีเรีย E. coli DH5α คัดเลือกโคโลนีที่ได้โดยใช้ X-gal เพื่อให้ได้โคโลนีสีฟ้าและสีขาวนำโคโลนีสีขาวที่ได้มาเลี้ยงเพื่อเพิ่มปริมาณ และนำมาสกัดพลาสมิดด้วย GenEluteTM Plasmid Miniperp kit (Sigma) นำพลาสมิดที่ได้มาหาลำดับเบสของชิ้นดีเอ็นเอ โดยใช้ BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystem) และใช้ universal primer คือ SP6 และ T7 ซึ่งมีลำดับเบสเป็น ‘5 ATTTAGGTGACACTATAG 3’ และ 5’ TAATACGACTCACTATAGGG 3’ ตามลำดับและทำพีซีอาร์ตามวิธีการซึ่งแนะนำโดย Applied Biosystem หาลำดับเบสโดยใช้เครื่องหาลำดับ เบสอัตโนมัติ ABI Prism 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystem Foster City, CA) นำชิ้นดีเอ็นเอที่ มีส่วนของไมโครแซทเทลไลท์มาออกแบบไพรเมอร์ โดยใช้โปรแกรม primer 3 (Rozen and Skaletsky, 2000) ผลการศึกษาวิจัยและวิจารณ์ จากการหาลำดับเบส ชิ้นดีเอ็นเอจาก 80 clones จาก genomic libraries สุจิตราและคณะ (2552) พบส่วนที่ เป็นไมโครแซทเทลไลท์ทั้งหมดมี 55 ชิ้นดีเอ็นเอ(clones)คิดเป็น เปอร์เซ็นต์ 76.36% ซึ่งประกอบด้วยส่วนที่ เป็นชุดซ้ำแสดงดังภาพที่ 3.2 โดยมีชุดซ้ำ CA/AC 23 ชิ้น, ชุดซ้ำ TG/GT 25ชิ้น, ชุดซ้ำ TA/AT 3 ชิ้น, ชุดซ้ำ GA/AG 3 ชิ้น และชุดซ้ำ CT/TC 1 ชิ้น มีความยาวโดยเฉลี่ยของชุดซ้ำเท่ากับ 9 ชุดซ้ำ (18 bp) โดยชุดซ้ำที่ สั้นที่สุดคือ (TC)3 และชุดซ้ำที่ยาวที่สุดคือ (GT)31 จากการนำชิ้นดีเอ็นเอที่มีส่วนของไมโครแซทเทลไลท์มา ออกแบบไพร์เมอร์ โดยใช้โปรแกรม primer 3 (Rozen and Skaletsky, 2000) ส่วนที่ออกแบบไม่ได้นั้น เนื่องจากส่วนที่เป็นชุดซ้ำนั้นอยู่ติดกับส่วนที่เป็นดีเอ็นเอเวคเตอร์มากเกินไปซึ่งมีจำนวนทั้งหมด 13 ชิ้น และ จากการทดสอบคู่ไพรเมอร์ทั้ง 42 คู่ ในเบื้องต้นพบว่า มี 10 คู่ไพรเมอร์ที่มี polymorphism แสดงดังภาพที่ 3.3 ตำแหน่งที่ให้อัลลีลต่ำสุดคือ 2 อัลลีล และตำแหน่งที่ให้อัลลีลสูงสุดคือ 5 อัลลีลโดยมีค่าเฉลี่ยของอัลลีล เท่ากับ 3.5 อัลลีลต่อตำแหน่งดังแสดงในตารางที่ 3.1 ภาพที่ 3.2 แสดงส่วนที่เป็นไมโครแซทเทลไลท์ซึ่งพบในไม้พะยูง (A) แสดงส่วนที่เป็นชุด CA 27 ซ้ำ (B) แสดงส่วนที่เป็นชุด TA 7 ซ้ำและ GT 16 ซ้ำ (ที่มา: สุจิตรา และคณะ, 2552) A B
การศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมโดยใช้เครื่องหมายดีเอ็นเอและไอโซเอนไซม์ยีน
To see the actual publication please follow the link above