209 กรณีศึกษาที่ 2: เสือ (Panthera spp.) การจำแนกชนิดพันธุ์สายพันธุ์และจำนวนตัวของเสือจาก ตัวอย่างชิ้นเนื้อและหนังเสือที่เป็น ของกลางโดยการถอดรหัสพันธุกรรมและการศึกษา DNA fingerprinting คำนำ เมื่อประมาณสิบกว่าปีก่อนกองคุ้มครองพันธุ์สัตว์ป่าและพืชป่าตามอนุสัญญาได้เคยส่งตัวอย่างชิ้นเนื้อสัตว์ ป่าของกลาง คือชิ้นเนื้อเสือ 17 ตัวอย่าง และสำนักงานอธิบดีกรมอุทยานแห่งชาติ สัตว์ป่าและพันธุ์พืช ได้ส่ง ตัวอย่างหนังเสือ 6 ตัวอย่าง รายละเอียดแสดงดัง ตารางที่ 25.1 มาให้สำนักวิจัยการอนุรักษ์ป่าไม้และพันธุ์พืช เพื่อตรวจหารหัสพันธุกรรมนั้นในการนี้สำนักวิจัยการอนุรักษ์ป่าไม้และพันธุ์พืชได้มอบหมายให้ ข้าพเจ้าซึ่ง ขณะนั้นทำหน้าที่หัวหน้ากลุ่มงานพันธุกรรมไม้ป่าและเทคโนโลยีชีวภาพ ซึ่ง Changtragoon and Singthong (2012) และ Changtragoon (2012) ได้ทำการศึกษาวิจัยพันธุกรรมของตัวอย่างดังกล่าว ซึ่งได้ ทำการวิเคราะห์โดยถอดรหัสพันธุกรรมจากยีนในไมโตรคอนเดรีย 7 ชิ้นส่วนของยีนเพื่อจำแนกชนิดพันธุ์และ กลุ่มของเสือ (subspecies) และ Changtragoon and Maklang (2010) และ สุจิตรา และพิษณุกร (2552) ใช้ไมโครแซทเทลไลท์มาร์คเกอร์ เพื่อวินิจฉัยจำนวนตัวของตัวอย่างแต่ละชนิด วิธีการวินิจฉัยพันธุกรรม การถอดรหัสพันธุกรรมมีวิธีการ ดังนี้ ได้มีการนำตัวอย่างเนื้อและหนังเสือมาสกัดดีเอ็นเอด้วยชุดสกัด DNeasy Tissue Kit (QIAGEN) แล้วนำดีเอ็นเอที่สกัดได้มาเพิ่มปริมาณยีน (PCR, polymerase chain reaction) ด้วยไพรเมอร์ซึ่งเป็นยีนใน ไมโทคอนเดรียจากการศึกษาของ Lou et al. (2004) ด้วย Primer ID 1 C1494F/T1936R (ND6; NADH dehydrogenase subunit 6) 2 C2339F/T2893R (CytB; cytochome b) 3 L14724/HCAT (CytB;cytochome b) Cracraft et al. (1998) 4 CR-UPF/CR-R2B (CR: control region)5 C8276F/T8620R (ND1; NADH dehydrogenase subunit 1) 6 T8942F/C9384R (ND2; NADH dehydrogenase subunit 2) แ ล ะ 7 C9366F/T9882R (ND2; NADH dehydrogenase subunit 2) และเชื่อมต่อชิ้นดีเอ็นเอหรือยีนเข้ากับ พลาสมิดใช้ชุด pGEM-T Easy Vector System I kit (Promega, USA) ซึ่งมาพร้อมกับพลาสมิด pGEMTeasy vector และถ่ายยีนเข้าสู่แบคทีเรียเจ้าบ้าน (host) เพื่อเพิ่มปริมาณพลาสมิดสายผสม โดยวิธี CaCl2 heat shock transformation (Sambrook et al., 1989) หลังจากนั้นตรวจยืนยันชิ้นดีเอ็นเอหรือยีนที่อยู่ ในพลาสมิดสายผสม หลังจากเพิ่มปริมาณในเซลล์เจ้าบ้านโดยใช้วิธีโคโลนีพีซีอาร์ และสกัดแยกพลาสมิดให้ บริสุทธิ์โดยใช้ชุดสกัด High Pure Plasmid Isolation Kit จาก Roche ในการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ ของยีนที่ศึกษา จากหลักการของวิธี Chain termination method ใช้ชุด Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) โดยทำพีซีอาร์ซึ่งจะติดฉลากด้วย ฟลูออเรสเซนต์ จากนั้นนำ PCR product ที่ได้ ไป ทำให้บริสุทธิ์ และนำสารละลายที่ได้มาวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไ ทด์
การศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมโดยใช้เครื่องหมายดีเอ็นเอและไอโซเอนไซม์ยีน
To see the actual publication please follow the link above