56 การสกัด DNA Total DNA ของไม้สักได้ถูกสกัดจากใบอ่อนของไม้สักแต่ละต้นโดยใช้ CTAB Buffer ซึ่งขั้นตอนการสกัด ได้ดัดแปลงมาจาก Doyle and Doyle (1990) และ Changtragoon et al. (1996b) ซึ่ง DNA ที่สกัดได้ ได้นำมา ละลายและเก็บรักษาใน TE buffer 0.1 mM EDTA การวิเคราะห์เครื่องหมายอาเอพีดี (RAPD markers) ในการศึกษาเครื่องหมายอาเอพีดี (RAPD) ในไม้สักได้เตรียมปฏิกิริยาการเพิ่มจำนวน DNA โดยสุ่มดังนี้ : ได้ใช้ 25 - 50 ng Template DNA, 0.3 uM Per random primer, 150 uM dNTPs, 1x reaction buffer, 0.5 U Tag DNA Polymerese (Quigen) โดยเตรียมในปริมาตร 25 ul (Changtragoon et al., 1996b; Lu et al., 1995) การเพิ่มจำนวน DNA (Amplification) ได้ใช้เครื่อง Thermocycler PTC 100 (MJ Research) โดยการตั้ง เวลา, อุณหภูมิ, จำนวนรอบที่จะเพิ่มจำนวน DNA แบบอัตโนมัติ Primer ที่ใช้ได้คัดเลือก 20 Primers จาก 220 Primers จาก Operon Technologies (Alameda, CA, USA) เพื่อใช้ในการศึกษาครั้งนี้ หลังจากที่ได้ Amplification products แล้ว นำ DNA ที่ถูกเพิ่มจำนวนโดยสุ่มมาวิ่งในกระแสไฟฟ้า 80 V ด้วยเครื่อง Submarine electrophoresis ที่มี 1.5 เปอร์เซ็นต์ Agarose gel แช่ใน 0.5 x TBE Buffer เป็นเวลา 2 ชั่วโมง 30 นาที โดยมี 1 Kb ladder (BRL) เป็น DNA standard รูปแบบของ DNA สามารถมองเห็นได้ภายใต้แสง UV และถ่ายภาพและ บันทึกภาพกล้องวีดีโอและ computer (Changtragoon and Szmidt, 2000) การคำนวณทางสถิติ สำหรับ Dominant markers เช่น RAPD Changtragoon and Szmidt (2000) ไม่สามารถคำนวณ ค่าความถี่ของยีน (Allele frequencies) ได้โดยตรง ดังนั้นการคำนวณค่าความถี่ของยีนจะสามารถทำได้โดยใช้วิธี Taylor expansion (Lynch and Milligan, 1994) ตำแหน่งของ RAPD ที่ถือว่าเป็น Polymorphic เมื่อความถี่ของ ยีนที่พบทั่วไปมากที่สุดไม่เกิน 95 เปอร์เซ็นต์ ของความถี่ของยีนที่พบทั้งหมดในแต่ละตำแหน่ง วิธีการประเมิน ความถี่ของ Dominant markers ในเนื้อเยื่อที่มีโครโมโซม 2 ชุดนั้นได้สันนิษฐานว่าแหล่ง (ประชากร) ที่ใช้ใน การศึกษาอยู่ภายใต้ Hardy - Weinberg equilibrium (HWE) การประเมินค่า Gene diversity ได้ใช้การคำนวณ ของ Nei (1978) ส่วนการคำนวณ Genetic variation ภายในและระหว่างแหล่ง (ประชากร) ได้การวิเคราะห์โดยวิธี ของ Weir and Cockerham (1984) และความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญของความถี่ของยีนได้ใช้วิธีการของ Fisher’s exact test (Raymond and Rousset, 1995) การคำนวณดังกล่าวข้างต้นได้ใช้ TFPGA computer program (Miller, 1997) ผลการศึกษาวิจัยและวิจารณ์ จากการศึกษา RAPD ในไม้ป่าชนิดต่างๆ Changtragoon and Szmidt (2000) พบว่าจำนวนของ Polymorphic loci ค่อนข้างสูง (Isabel et al., 1995) ซึ่งการศึกษาครั้งนี้ก็สอดคล้องกับการศึกษาข้างต้น ใน การศึกษาครั้งนี้เราสามารถใช้ 20 Primers ในการวินิจฉัย 51 Putative RAPD Loci ในไม้ป่า RAPD จะมีระดับของ Polymorphism พอๆ กันหรือมากกว่า Markers ชนิดอื่น (Chong et al., 1994; Isabel et al., 1995; Liu and Furnier, 1993; Szmidt et al., 1996b) ในการวัดค่า Genetic variability โดย ใช้ RAPD ในการศึกษาครั้งนี้มีความ สอดคล้องกับการศึกษาข้างต้น สัดส่วนของ Polymorphic loci ที่ได้จากการศึกษาครั้งนี้ ที่ 0.95 Criterion พบว่ามี
การศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมโดยใช้เครื่องหมายดีเอ็นเอและไอโซเอนไซม์ยีน
To see the actual publication please follow the link above